卡梅德生物科技（天津）有限公司
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地址：天津市武清區國際企業社區A5號樓四層，301700
郵箱：info@kmdbioscience.com
?卡梅德生物(KMD?Bioscience)能夠為客戶提供高質量的、駱駝來源的VHH抗體噬菌體展示文庫制備服務。我們的科學家采用人用疫苗級別和生物制藥的QbD（Quality?by?Design）設計原則，在理解和尊重ICH原則的基礎上，設計并制備駱駝VHH抗體噬菌體展示文庫，為客戶提供全程可追溯的產品追溯體系和文件支撐體系，包括抗原設計，動物免疫，文庫構建與篩選，功能驗證等主要環節。
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駱駝抗體文庫制備-重鏈抗體背景：
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傳統意義上血清抗體主要包括IgG1，IgG2，IgG3和IgG4 四種亞型，而駱駝主要血清抗體包括IgG1，IgG2和IgG3三種類型，其中IgG1與傳統抗體結構相似，含有2條重鏈和2條輕鏈；IgG2和IgG3缺少CH1和輕鏈結構域，因此也被稱為重鏈抗體(heavy Chain Antibody，hcAb)，如圖1所示：
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圖1 經典抗體與重鏈抗體模式結構
(a) 傳統抗體及其Fab/scFv抗體形式 (b) 重鏈抗體及其VHH抗體形式
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重鏈抗體在羊駝和駱駝血清中的分部是不均衡的，駱駝血清抗體中重鏈抗體占比約為60-75%，羊駝血清抗體中重鏈抗體占比約為40-50%。這種顯著的差異導致了構建的駱駝VHH抗體文庫具有先天的優勢，如表1所示。駱駝抗體文庫主要是指利用駱駝重鏈抗體的可變區，即VHH區域序列構建的VHH抗體文庫，又叫納米抗體文庫。VHH抗體的特點是只含有重鏈抗體的抗原結合區，如圖2所示，氨基酸長度約為110AA，SDS-PAGE顯示分子量約為15kDa（遠小于傳統抗體150kDa的分子量），具有較好的穩定性，能夠抵抗低pH環境。 同時在VHH人源化改造方面，也具有良好的適應性，容易滿足Car-T等免疫細胞的改造和分選實驗要求。
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圖2 駱駝重鏈抗體與VHH抗體模式
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駱駝與羊駝VHH抗體文庫對比：
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比較項目 |
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抗原耐受量 |
高，多種抗原混合，高劑量免疫 |
較高，多種抗原混合中等免疫劑量 |
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抗血清滴度 |
高 |
高 |
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中和抗體效價 |
高 |
較高 |
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抗體親和力 |
更容易獲得高親和力抗體 |
能夠獲得高親和力抗體 |
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抗原需求量 |
4-6mg，純度>85% |
2-3mg，純度>85% |
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采血量 |
一次可采血200ml |
一次80-100ml血液 |
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PBMC細胞量 |
高 |
一般 |
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有效庫容 |
高，免疫庫108-109 |
高，免疫庫107-108 |
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動物成本 |
較低 |
高 |
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小分子抗原反應性 |
高 |
一般 |
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文庫制備-駱駝VHH抗體庫構建服務：
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卡梅德生物科技(KMD Bioscience)能夠為客戶提供高質量的、駱駝來源的VHH抗體噬菌體展示文庫制備服務。我們堅持采用人用疫苗和生物制藥的QbD（Quality by Design）設計原則，在理解和尊重ICH原則的基礎上，設計并制備駱駝VHH抗體噬菌體展示文庫，為客戶提供全程可追溯的產品追溯體系和文件支撐體系。VHH抗體噬菌體展示文庫包含抗原設計，動物免疫，文庫構建與篩選等主要環節。
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VHH抗體噬菌體展示文庫-抗原設計：
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針對駱駝VHH抗體文庫，我們設計了一系列來自于駱駝抗體Fc融合表達的人源免疫檢查點蛋白。結合我們成熟的Freestyle 293F和Expi CHO細胞懸浮表達平臺，我們能夠為客戶在較短的周期內從基因合成，載體構建到克級蛋白的表達，更多的服務需求，請咨詢我們的蛋白表達平臺。同時，根據我們的實驗結果，我們發現小分子靶蛋白直接與人源Fc片段融合后免疫效果要好于靶蛋白融合駱駝Fc片段后免疫結果（具體實驗結果，請聯系我們的技術人員）。
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VHH抗體噬菌體展示文庫之文庫構建與篩選：
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卡梅德生物(KMD?Bioscience)的駱駝種群來源于歐洲，公司可以提供未經免疫的，足齡（24-36月齡）的駱駝進行抗原免疫，按照標準免疫方法，每個項目免疫5-6針，免疫期間為客戶提供ELISA效價測定服務，保證抗血清ELISA效價合格后采血分離PBMC。
卡梅德生物(KMD Bioscience)采用M13噬菌體的pIII蛋白進行VHH抗體(納米抗體)表面展示。我們的科學家構建了帶有Flag和6*His tag雙標簽的噬菌體載體，同時制備出了具有108轉染效率的TG1和XL1-Blue宿主菌感受態，經過2-3次轉染與擴增，能夠為客戶提供有效庫容量為108-109，且包裝庫容為1013-1016/ml顆粒數的高質量VHH抗體展示文庫。通過抗原極限施壓篩選方式，經過3輪納米抗體文庫淘篩，即可獲得多達20-30株具有高親和力的噬菌體株。通過簡單的IPTG誘導，即可在1-2周內獲得大量抗體表達產物，以滿足客戶FACS，細胞活性測試等研究需求。
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駝源抗體文庫制備---項目流程：
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步驟 |
服務內容 |
周期 |
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Step1：動物免疫 |
* 準備1只健康、足齡雙峰駝(28-36月齡)
* 免疫駱駝5-6次
* ELISA檢測血清效價，效價滿足要求后取外周血；若效價不滿足要求，則終止試驗 |
6-8周 |
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Step2：抗體cDNA制備（客戶可以直接提供細胞，從此步開始） |
* 總RNA提取
* 高保真RT-PCR制備cDNA |
3-4周 |
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Step3：構建抗體庫 |
* 引物設計與合成：抗體可變區兼并引物設計、合成
* 以cDNA為模板，PCR擴增重鏈抗體基因可變區
* 噬粒構建與轉化：酶切、連接噬菌粒載體，電擊轉化TG1宿主菌，構建抗體庫
* 鑒定：隨機挑選96個克隆，PCR鑒定陽性率
* 包裝，＞1?1013?/ml噬菌體顆粒 |
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Step4: 文庫淘篩
(3輪) |
* 抗原極限施壓法進行3輪淘篩
* 鑒定：隨機挑選96個克隆，ELISA效價測定
* 多達96個陽性克隆進行基因測序，挑選10-15個克隆進行原核表達轉化
* 10-15個陽性克隆表達制備VHH抗體上清 |
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3-4周 |
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交付 |
* 構建與篩選報告，包括測序報告，圖片數據 * VHH抗體文庫2ml，＞1?1013?/ml噬菌體顆粒
* 10-15個陽性克隆表達制備VHH抗體上清
* 10-15個陽性克隆表達菌種 |
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注：1.客戶提供駱駝外周血淋巴細胞，淋巴結細胞或脾臟細胞（保存在RNA later等溶液中，避免RNA降解，藍冰運輸），從第二步開始制備VHH抗體文庫，只需3-4周即可完成。
2.?采用TriZol溶液制備細胞裂解物，干冰運輸。
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駱駝抗體文庫制備服務優勢 ：
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--同時提供免疫庫制備服務和天然駱駝抗體文庫篩選服務
--周期短，約16-20周即可獲得高質量的文庫和單抗細胞株
--高庫容量：有效庫容 108?– 109/免疫庫；109?– 1011/天然庫
--高親和力抗體制備
--個性化的淘篩策略
--完整的文件追溯體系和QC質控文件
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駝源抗體文庫制備----實驗流程：
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如何訂購？
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